在動物細胞培養過程中，必須有可以貼附的支持物表面，其依靠自身分泌或培養基中的貼附因子才能在該表面生長增殖的離體動物的培養細胞。那么貼壁細胞培養的步驟有那些呢？讓我們一起來看看吧！

1. 將含有凍存細胞的安瓿放入37℃水浴中解凍。

2. 用70%乙醇對安瓿的頂端進行消毒，打開安瓿，用吸管將細胞轉移到含有5ml起始培養基的25cm2組織培養瓶中，輕輕搖動培養瓶，使細胞均勻分布于培養瓶中，將其放入5%CO2加濕培養箱中37℃培養過夜。

3. 吸出起始培養基，換成適當的維持培養基。將細胞放回CO2培養箱37℃培養，每天檢查細胞是否生長至匯片。

4. 如果細胞生長至匯片，吸出培養基。

5. 用PBS或胰酶/EDTA清洗細胞，除去細胞上殘留的血清，將洗液吸出。

6. 用37℃、適當體積的胰酶/EDTA剛好覆蓋單層細胞（如對于25cm2培養瓶需要0.3ml）。消化30～40s（細胞應該分開），晃動培養瓶使細胞wan全分開。

7. 加入1.4ml適當的維持培養基，用吸管來回吹打細胞懸液多次以打散細胞團（這些細胞用于傳代）。

8. 吸出0.5mL的細胞懸液，將其加入到新的含有30ml維持培養基的組織培養瓶中。輕輕搖動培養瓶，使細胞均勻分布于培養瓶中，將其放入CO2培養箱中37℃培養直到細胞生長至匯片（大約1周）。大約間隔一周用維持培養基進行1:20稀釋傳代以維持細胞生長。

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